Методика постановки реакции диффузионной преципитации (РДП) для серологической диагностики инфекционной анемии лошадей
(Рекомендована Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 5 мая 1977 г.)
1. Введение
1.1. Реакция диффузионной преципитации в геле – специфический лабораторный метод, основанный на обнаружении антител к вирусу инфекционной анемии лошадей в сыворотке крови при остром, хроническом и латентном течении инфекции.
1.2. Специфические преципитирующие антитела появляются в крови животных через 2-6 недель после инфицирования и сохраняются на протяжении длительного времени (более 7 лет).
2. Компоненты реакции.
2.1. Для проведения исследований необходимы: преципитирующий антиген; положительная преципитирующая сыворотка; испытуемые сыворотки; очищенный агар «Дифко»; боратный буферный раствор, рН 8,6.
2.2. Антиген и положительная сыворотка представляют собой стерильные лиофилизированные препараты, расфасованные в ампулы и не содержащие активного вируса. На каждой ампуле указывают рабочее разведение антигена или сыворотки. Лиофилизированные препараты сохраняют в холодильнике при температуре 4 С. Срок годности препаратов – 2 года. Он может быть продлен после проверки активности антигена и сыворотки в РДП. Сухие препараты растворяют дистиллированной водой, а рабочие разведения готовят на боратном буфере. После растворения диагностикумы сохраняют при минус 10 С в течение 10 дней.
2.3. Испытуемые сыворотки получают от исследуемых лошадей в количестве 5-6 мл. Их консервируют мертиолятом 1:10000 или путем добавления антибиотиков – пенициллина и стрептомицина по 1000 ЕД/мл и хранят при температуре 4-8 С. Сыворотки без консерванта хранят в замороженном состоянии.
2.4. Боратный буфер готовят по следующей прописи: едкий натр (NaOH) – 2 г; борная кислота (H3BO3) – 11 г; вода дистиллированная до 1 л. Раствор имеет рН 8,6. Используются для реакции химические реактивы «чистые для анализа» (ЧДА).
2.5. Для приготовления агарового геля используют агар «Дифко» и боратный буфер (рН 8,6). 1%-ный и 2%-ный агар готовят путем кипячения или автоклавирования (без давления) в течение 5 мин. В чашку Петри диаметром 9-10 см сначала вносят 5 мл горячего 2%-ного агара и дают ему застыть. Затем, не сдвигая чашек с места, во избежание неравномерного распределения агара, вносят 15 мл (охлажденного до 600С) 1%-ного агара и после застывания среды приступают к вырезанию лунок. Лунки вырезают только в слое 1%-ного агара с помощью металлического пробойника диаметром 7 мм. Одна лунка должна располагаться в центре и шесть – по окружности на расстоянии 3 мм от центральной лунки и друг от друга. Для того чтобы лунки были расположены на равных расстояниях, под чашку необходимо подкладывать трафарет или пользоваться специально изготовленным пробойником из 7 жестко закрепленных трубочек. Агаровые пробки удаляют иглой, пинцетом или канюлей, соединенной с вакуумной установкой. Необходимо избегать удаления и повреждения нижнего 2%-ного слоя агара или расслоения слоев. Если в лунках накапливается влага, то ее отсасывают пипеткой перед внесением реагентов.
3. Постановка реакции.
3.1. Используют 2 схемы заполнения лунок. Первая – в центральную лунку вносят микропипеткой 0,05-0,06 мл антигена. В три периферических лунки, через одну, закапывают 0,05-0,06 мл положительной сыворотки. Оставшиеся три свободные лунки заполняют с помощью тонко оттянутой пастеровской пипетки исследуемыми сыворотками. При этом в одной чашке Петри исследуют 12 проб сыворотки.
3.2. В случае проведения массовых исследований может быть использована вторая схема заполнения лунок, которая позволяет в одной чашке одновременно использовать 16 проб. В центральную лунку вносят антиген, в две периферические, диаметрально противоположные лунки – контрольную положительную сыворотку и в оставшиеся четыре – испытуемые сыворотки. Для каждой пробы сыворотки используют отдельную пастеровскую пипетку.
3.3. Необходимо обращать особое внимание на правильность заполнения лунок. Антиген и сыворотки вносят с таким расчетом, что бы жидкость не растекалась по поверхности агара. После заполнения лунок чашки Петри закрывают крышками и помещают во влажную камеру при температуре 18-25 С.
4. Учет реакции.
4.1. Реакцию учитывают через 48-72 ч. Чашки просматривают на темном фоне в косонаправленном пучке света. Для этой цели используют осветитель ОИ-19. Реакцию учитывают по контрольной линии преципитации, но если она отсутствует или слабо выражена, то исследование необходимо повторить. Контрольные линии преципитации должны быть четкими, расположенными посредине между лунками с антигеном и контрольной положительной сывороткой.
4.2. Существенный сдвиг контрольных линий преципитации при правильном заполнении лунок является показателем снижения активности диагностикумов. В этом случае сухой препарат (антиген или сыворотку) растворяют в 2 раза меньшем объеме дистиллированной воды и проверяют в РДП в разведении 1:1,25; 1:1,5; 1:1,75. За рабочее разведение принимают то разведение диагностикума, которое дает четкую линию преципитации, расположенную посредине между лунками с антигеном и контрольной положительной сывороткой.
4.3. Оценка результатов реакции.
Отрицательная - контрольные линии продолжаются в сторону лунки с испытуемой сывороткой без изгибов или с небольшим изгибом в сторону контрольной положительной сыворотки (рис.3 и 4, лунка 3).
Положительная:
а) между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном образуется полоса преципитации, которая соединяется с контрольной линией (рис.3 и 4, лунка 1);
б) линия преципитации отсутствует, но контрольные линии образуют вблизи с испытуемой сывороткой изгиб, направленный в сторону антигена – слабоположительная сыворотка (рис. 3 и 4, лунка 2);
в) контрольные линии укорачиваются со стороны лунки с испытуемой сывороткой, в отдельных случаях контрольные линии полностью растворяются, что свидетельствует о высоком титре антител (рис 3 и 4, лунка 6). Более различимые преципитации будут образовываться, если эти пробы развести 1:4 или 1:8 и повторить реакцию.
Сомнительная реакция – слабый изгиб контрольной линии плохо просматривается; образуются интенсивные неспецифические линии или ореол вокруг лунок, что затрудняет учет реакции.
От животных, давших сомнительную реакцию, через 2-3 недели берут кровь и исследования повторяют. Пробы сыворотки, давшие при повторном исследовании отрицательный результат, считают отрицательными. При получении повторной сомнительной реакции результат исследований считают положительным.
Неспецифическая преципитация образуется с некоторыми пробами сыворотки, особенно полученными от старых лошадей. Признаком неспецифической реакции является перекрещивание линий преципитации с контрольными (рис.3 и 4, лунки 5 и 4). В одной и той же пробе сыворотки могут быть специфические и неспецифические антитела.
4.4. При образовании интенсивного ореола вокруг лунок, затрудняющего учет реакции, эти пробы сыворотки исследуют повторно, добавив к агару 5% хлористого натрия. Для этого к 100 мл буфера добавляют 5 г химически чистого хлористого натрия.
4.5. Жеребят, полученных от положительно реагирующих в РДП кобыл, исследуют после отъема в возрасте 6-8 мес.
4.6. Результаты реакции регистрируются в специальных журналах, которые должны быть прошнурованы, пронумерованы и скреплены печатью учреждения.
